انتاج وتوصيف لنقي المنتجات الايضية لعزلة Streptomyces ودراسة تاثيراتها المضاد حيوية والسرطانية == Production and Characterization of Purified Metabolites from Streptomyces Isolate and Study
Author name:
ليندا حميد تركي عطية الغزالي
Supervisor name:
رباب عمران راضي الجيلاوي
General topic:
Biology
Specific topic:
Biotechnologies
Degree:
Doctorate
University:
University of Babylon - College Of Science - Department Of Biology
Language:
English
University location:
Babylon
First pages:
24T3514 - p.pdf
Abstract:
شملت الدراسة الحالية جمع 100 عينة من الترب بواقع 50 عينة من ترب صحراوية جمعت من المناطق التي تبعد مسافة 3 كيلومترات من بحيرة الرزازة و50 عينة من ترب زراعية جمعت من مناطق مختلفة من محافظه كربلاء المقدسة. حيث عزلت 26 عزلة من البكتريا الخيطية من الترب الصحراوية و36 عزلة من البكتريا الخيطية من الترب الزراعية ودرست الفعالية التضادية لهذه العزلات ضد اربعة انواع من البكتريا المرضية ( بكتريا الموجبة لصبغة كرام Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae وبكتريا السالبة لصبغة كرام (Escherichia coli and Pseudomonas aeru¬ginosa وبطريقة التخطيط العمودي, واظهرت النتائج ان جميع actinomycetes المعزولة من الترب الزراعية ليست لها اي فعالية مضادة للبكتريا المرضية بينما كانت لبكتريا actinomycetes المعزولة من الترب الصحراوية فعالية مضادة للبكترياالمرضية وبمديات مختلفة تبعا لنوع البكتريا المرضية المدروسة, وقد وجد ان لثمانية من عزلات actinomycetes الصحراوية فعالية مضادة للبكتريا المرضية السالبة والموجبة لصبغة كرام وتبعا لذلك المدى الواسع في التثبيط اختبرت فعاليتها المضادة بطريقة الانتشار بالحفر, واظهرت النتائج ان العزله LHR 9 actinomycetesلها فعالية مضادة للبكتريا المرضية اعلى من العزلات الاخرى المختبرة وباستخدام طريقة الانتشار بالحفر, لذلك اختيرت لاكمال محاور الدراسة المتقدمة. درست الصفات المظهرية والبايوكيمياوية والزرعية للبكتريا actinomycetes LHR 9 بعد زرعها على اوساط زرعية مختلفة من وسط استخلاص Streptomyces الدولي واعتمادا على الفحص المجهري باستخدام المجهر الضوئي المركب وتحت قوى تكبير 1000و400مره لدراسة شكل المايسليوم الهوائي والارضي, وقد تبين ان للعزلة مايسليوم هوائي متفرع له مظهر مفصص وغير مجزا وباستخدام المجهر الاليكتروني الماسح تبين ان المايسليوم يحمل ابواغا ملساء وغير متحركة, وبالاعتماد على مجمل الصفات الزرعية والفسيولوجية المدروسة تبين ان البكترياLHR 9 actinomycetes المعزولة تعود لجنس Streptomyces. درست عدد من الظروف الزرعية والغذائية المثلى لتحسين انتاج مواد الايض الثانوي من البكتريا في وسط التخمر وقد كان وسط فول الصويا الحاوي على الدكستروز كمصدر كاربوني والبيبتون كمصدر نتروجيني وK2HPO4 كمصدر فوسفاتي وبظروف تخمر : بدرجه حراره 35م0 , وحموضه 7 , وقوه اهتزاز 200دوره \ دقيقه ولمده 7 ايام كفتره حضن هو وسط الانتاج الامثل . استخدمت مذيبات عضوية مختلفة القطبيةn) - بروبانول وكلوروفورم وخلات الاثيل ووالاسيتون والميثانول والايثانول (في استخلاص مواد الايض الثانوي المنتجة من بكتريا Streptomyces sp. LHR 9 المضادة للبكترياالمرضية وقد كان المذيب العضوي خلات الاثيل افضل المذيبات العضوية في الاستخلاص اذ اعطى مستخلصه البكتيري اعلى قيم في التثبيط البكتيري . نقيت مواد الايض الثانوي بعد استخلاصها بخلات الاثيل بعمود الفصل : جيل السيليكا ذو الابعاد (1.6× 14) سم وباستخدام الميثانول والكلوروفورم بنسبه 8 : 2 حجم\حجم كمحلول الغسل لسم3 واحد من المستخلص البكتيري , وقد جمع 50 جزء من المحلول الناتج بعد الغسل واختبرت فعاليتهاالتثبيطية لنمو البكتريا المرضية , وقد اعتمدت الاجزاء الفعالة لقياس التركيز المثبط الادنى باستخدام طريقة الانتشار من القرص, وقد كانت التراكيز (4.5 , 5 , 2.5 ,3)مايكروغرام/مل هي التراكيز المثبطه الدنيا لبكتريا Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aurues , Streptococcus agalactiae على التوالي. قيمت السمية الخلوية لمواد الايض الثانوي والمنقاة جزئيا لتحديد مدى فعاليتها المضاده للسرطان وبالاعتماد على فحص MTT (3 - (4, 5 - dimethylthiazol - 2 - yl) - 2 - 5 - diphenyl tetrazolium bromide) وباستخدام خطوط خلايا الثدي السرطانية وخطوط خلايا سليمة, وقد اظهرت النتائج بان التركيز 400مايكوغرام\ مل هو التركيز الامثل لتثبيط نمو الخلايا السرطانية بنسبه 60% مع المحافظة على 80% من الخلايا السليمة. اعتمدت الكروماتوغرافيا السائلة Liquid Chromatography - Mass Spectroscopy (LC - MS) في تنقية المركب الفعال وتوصيفة اذ اظهرت نتائج المخطط اللوني ان هنالك خمسة قمم وبالمقارنة مع الاطياف الكتلية للمركبات حسب المعهد الامريكي للمعايير والتقنية National Institute of Standards and Technology ان للمركب صيغة كيمياوية C18H32O2 ووزن جزيئي 282دلتن . درست الفعالية المضادة للاكسدة والمضادة للاورام لمستخلص Streptomyces sp. LHR 9 (المنقى جزئيا) في اناث الجرذان المختبرية المحفزة للاصابة بسرطان الثدي كيمياويا باستخدام مادة 7,12 dimethyl Benz (A) anthracene (DMBA) واظهرت النتائج ان لمستخلص LHR 9 Streptomyces sp. (المنقى جزئيا) القدره على المحافظة على تركيز الانزيمات المضادة للاكسدة في مصل الحيوانات المعاملة بمادة DMBA وبقيم مقاربة لما هي موجودة في مصل الحيوانات السليمة وقد تمثلت اثار ذلك بصغر وزن وحجم الورم فيى منطقة الثدي والتغيرات النسيجية الملحوظة, وعلى مستوى جزيئ ايضا اذ لوحظ وباستخدام تقنية Polymerase Chain Reaction - Single Strand Conformation Polymorphism(PCR - SSCP) التغيرات الوراثية الحاصلة للجينين ( Bcl - 2 وCaspase - 3) بفعل مادة DMBA ودور مستخلص Streptomyces sp. LHR 9 (المنقى جزئيا) في الحفاظ على الشكل الطبيعي للجينين اذ تبين ان هناك83.66% من الحيوانات السليمة و50% من الحيوانات المعاملة بالمستخلص البكتيري تمتلك جين Caspase - 3 بشكله الطبيعي بينما 66.66% من الحيوانات التي عوملت بماده DMBA فقط تمتلك جين Caspase - 3 من النوع الطافر وكذلك بالنسبة للجين Bcl - 2 اذ تبين ان هناك 78.66% من الحيوانات السليمة و60% من الحيوانات المعالجة بالمستخلص البكتيري تمتلك جين Bcl - 2من النوع الطبيعي بينما لوحظ وجود نفس الجين ولكن من النوع الطافر بنسبة 66.67% في الحيوانات المصابة بسرطان الثدي بتاثير مادة DMBA. | The present study included the collection of 100 soil samples from desert regions away from about 3 km from Al - Razzaza lake and agricultural regions at Karbala Province, Iraq. From these samples 26 and 36 actinomycetes isolates were obtained from desert and agricultural regions respectively . All actinomycetes isolates were tested for their antibacterial activity using primary screening against pathogenic bacteria by perpendicular streaking method .The results were showed that all the actinomycetes isolates were isolated from agricultural regions hadn't any antibacterial activity while the 26 isolates isolated from desert regions were had antibacterial activity in different spectra . Eight actinomycetes isolates from all the 26 desert regions isolates were selected for secondary screening due to their antibacterial activities with wide spectrum against pathogenic bacteria namely Gram positive (Staphylococ¬cus aureus and Streptococcus agalactiae) and Gram negative (Escherichia coli and Pseudomonas aeru¬ginosa) by the agar diffusion methods and the results revealed the selection of actinomycetes LHR 9 isolate for farther studies because it gave us the highest inhibition against the tested pathogenic bacteria growth. The active actinomycetes LHR 9 isolate was identified using several morphological and biochemical methods. The morphological characterization was involved the study of aerial and substrate mycelium on many International Streptomyces Project agar medium and using light microscopy at 1000X and 400X to study the mycelium morphology, as well as using the scanning electron microscope (SEM) to examine the spore surface. The results exhibited that the isolate had the aerial mycelium which formed unfragmented, branched, looped and rectus - flexibilis hyphae type bearing non - motile spores with smooth surface. In addition to results of biochemical tests we could revealed that the isolate was belong to Streptomyces genus . The active isolate Streptomyces sp. LHR 9 was selected for optimization critical cultural and nutritional parameters for increasing the antibiotic production titer in fermentation medium (Soybean broth medium), the results showed the dextrose as carbon source , peptone as nitrogenous source and K2HPO4 as a phosphate source with fermentation cultural condition included ; temperature of 35 °C, pH 7 with agitation rate 200 rpm for 7 days as incubation period gave high values in active secondary metabolites production. The antibacterial compound from fermentation medium was extracted using liquid - liquid extraction method with various organic solvents n - propanol, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol and ethanol) 1 : 1 (v/v) . the results was revealed the ethyl acetate the most efficient in extraction . The Streptomyces sp. LHR 9 crude extract was purified by using silica gel column (1.6 X 14) chromatography. Chloroform and methanol (4 : 1) (v/v), was used as an eluting solvent. The active fractions ( had the antibacterial activity ) were selected for determination the minimum inhibitory concentration and evaluation the cytotoxic activity using MTT (3 - (4, 5 - dimethylthiazol - 2 - yl) - 2 - 5 - diphenyl tetrazolium bromide) assay. The results of the MIC of partially purified Streptomyces sp. LHR 9 extract were 4.5 µg/ml for Escherichia coli, 5 µg/ml for Pseudomonas aeruginosa, 2.5µg/ml for Staphylococcus aurues and 3µg/ml for Streptococcus agalactiae . In vitro screening for cytotoxic activity was done by MTT assay for evaluation the anticancer activity of the partially purified antibacterial compounds produced by Streptomyces sp. LHR 9. The cytotoxic activity of the partially purified Streptomyces sp. LHR 9 extract was determined against established MCF - 7 cell line ( breast cancer cell lines ) and WRL cell as a representative of normal breast cell line, depending on their viability ratio. The viability of MCF - 7 cell line was decreased dramatically with the increasing in extract concentration in the same time the viability of WRL cell was decreased in slowly manner. The using of multiple purification methods Liquid Chromatography - Mass Spectroscopy (LC - MS) along with a sensitive measuring method and possibly isolation of these compounds should allow us to evaluate the entire potential of secondary metabolites production, the results from LC - MS chromatogram of the partially purified Streptomyces sp. LHR 9 extract showed five peaks, on comparison of the mass spectra of the constituents with the National Institute of Standards and Technology( NIST) library the compound was had the Formula : C18H34O2 and molecular weight : 282 D. The partially purified Streptomyces sp. LHR 9 extract was evaluated for its in vivo antioxidant and antitumor activity depending on the ability of 7,12 dimethyl Benz (A)anthracene (DMBA) to inducing breast tumor in female rat model, the results revealed the partially purified Streptomyces sp. LHR 9 extract had the ability to keeping the enzymatic antioxidant in approximately its natural concentrations (as the same concentrations in serum of negative group) in serum of tested rats which were induced breast cancer by DMBA and treated with partially purified Streptomyces sp. LHR 9 extract, so these results were more studied on histological plane and the results of that were achieved by decreasing in weight and size of the breast tumor of tested rats and other histological change in breast tissue. In addition to that partially purified Streptomyces sp. LHR 9 extract effect was more studied on molecular plane depending on the Bcl - 2 and Caspase - 3 genes mutation using Polymerase Chain Reaction - Single Strand Conformation Polymorphism ( PCR - SSCP) analysis. The results were two conformations polymorphism in both Caspase - 3 gene ( about 83.66 % of negative group and 50% of treated group had three bands (wild type) where's positive control had 66.66% four bands (mutant type)) and Bcl2 gene (the wild type had one band such as negative group was 78.66% and test group 60%, compared with positive group (60.67%) have two bands(mutant type)). so these results suggest the active apoptotic property of Caspase - 3 and Bcl - 2 and the role of partially purified Streptomyces sp. LHR 9 extract effect in keeping them in their wild type.
