استخلاص بكتريوسين من العنقوديات الذهبية لعينات سريرية واختبار قدرته العلاجية وتاثيره في الخلايا السرطانية والطبيعية == Extract bacteriocin from Staphylococcus.aureus of clinical samples and test it´s curing ability and effects in cancerous and normal cells
Author name:
اسما سميع افرام كرومي
Supervisor name:
ناهي يوسف ياسين | علي صالح حسين
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology
Degree:
Master
University:
Tikrit University - Faculty Of Education
Language:
Arabic
University location:
Salahaddin
First pages:
24T3154 - p.pdf
Abstract:
صممت هذه الدراسة لغرض تقييم القدرة العلاجية للبكتريوسينات المنتجة بواسطة عزلات سريرية من بكتريا المكورات العنقودية الذهبيةStapylococus aureus ضد الاورام السرطانية للغدة اللبنية المغروسة في اناث الفئران البيضاء ودراسة تاثيراتها في الخلايا اللمفاوية لمزارع الدم الكامل للانسان وخمس من خطوط الخلايا السرطانية والطبيعية المعاملة في الزجاج.اشتملت الدراسة على ما ياتي : - عزل وتشخيص افراد النوع Stapylococus aureus من عينات سريرية لاصابات جرثومية معظمها من جروح(33عينة) وحروق(13عينة) ودمامل(33) من مرضى راقدين في مستشفيات السلام, الخنساء, ابن الاثير, ابن سينا والمستشفى الجمهوري في محافظة نينوى للمدة من الاول من شباط ولغاية الاول من اب للعام 2007 , عزل وتوصيف السلالات المنتجة للبكتريوسينات, استخلاص البكتريوسينات المنتجة بواسطة السلالات الكفوءة, تنقية وتوصيف البكتريوسينات المستخلصة, تقييم القدرة العلاجية للبكتريوسينات المستخلصة ضد الاورام السرطانية للغدة اللبنية المغروسة في اناث الفئران البيضاء, تقدير تاثير البكتريوسين المستخلص في الخلايا اللمفاوية لمزارع الدم الكامل للانسان المعاملة في الزجاج, وتقدير تاثير البكتريوسين المستخلص في خمس من خطوط الخلايا السرطانية والطبيعية.تم التقييم باستعمال الطرق الاتية : - تقدير الشذوذ الكروموسومي في خلايا نقي العظم, تقدير الشذوذ الكروموسومي في الخلايا المولدة للنطف, تقدير التشوهات المظهرية في النطف الناضجة, تقدير التلف الوراثي في الخلايا الكبدية بواسطة تقنية Comet assay, تقدير التلف الوراثي في الخلايا اللمفاوية للانسان بواسطة اختبار النواة الصغرى واختبار تبادلات الكروماتيدات الشقيقة, تقدير التاثير التثبيطي في نمو الخلايا السرطانية والطبيعية الناتج عن المعاملة مع تركيزات مختلفة من البكتريوسين ولفترات زمنية مختلفة.تم الحصول على (163) عزلة نقية لبكتريا المكورات العنقودية الذهبية من اصل (250) عينة سريريه جمعت من اصابات الجروح والحروق والدمامل. كانت 14\ 163 عزلة منتجة كفوءة وقد ظهر ان عزلتين منها كانت احداها ذات فعل محلل للدنا ومحطمة للغشاء السايتوبلازمي اما الثانية فكانت ذات فعل محلل للدنا وليس لها تاثير على الغشاء الخلوي, وهما العزلتين التي تم استخدامهما في انتاج البكتريوسينات التي تم اختبار تاثيراتها في هذه الدراسة. اظهرت العزلات المستخدمة في الدراسة مقاومة متباينة لخمسة عشر نوعا من المضادات الحيوية.تم استخلاص البكتريوسين وكان من النوع الحر غير المرتبط, وقد اظهر ثباتية عند الخزن بدرجة 4ﹾ م. رسب البكتريوسين بواسطة كبريتات الامونيوم واجري الفصل بواسطة عمود السيفادكس 100G, ثم جفدت المادة وتم وزن المسحوق واستخدامه في تحديد الجرعة المميتة النصفية وكانت قيمتها210,215mg/kg.bw. والجرعات المستخدمة في المعاملات العلاجية ودراسة السمية الوراثية وهي 2 /1 و10 /1 قيمة LD50 . واستخدمت الجرعة100 /1 من قيمة LD50 وسلسة التخفيفات النصفية لها في معاملة الخلايا اللمفاوية لمزارع الدم الكامل للانسان وخطوط الخلايا السرطانية والطبيعية. ترافقت انواع الشذوذ الكروموسومي مع ازدياد حجم الورم المغروس في الفئران وكانت على نوعين, شذوذ تركيبي بشكل كسر كروموسومية وسلسلة رباعية, اما بالنسبة للشذوذ العددي فكان من نوع الوهن السنتروميري والانقسام الميتوزي الداخلي. كما اظهرت المعاملة داخل الجسم مع البكتريوسين انواع من الشذوذ الكروموسومي في كل من خلايا نقي العظم والخلايا الابتدائية المولدة للنطف, حيث لوحظت السلسلة الرباعية واحاديات X - Y والاحاديات الجسميةو التعدد المجموعي الكروموسومي. اما بالنسبة للتشوهات في الشكل الظاهري للنطفة الناضجة فقد لحظ الراس غير المنتظم, الراس فاقد النتوء , الراس الصغير, الراس الكبير والراس الشبيه بالموز, كما لحظ الذيل الملتف. تسببت المعاملة العلاجية مع كل من المستخلصينB6 وB11 الى تحسن الفعالية الميتوزية وخفض حدوث انواع الشذوذ الكروموسومي التركيبي والعددي, حيث كان متوسط مجموع احداث الشذوذ الكروموسومي 8.4±0.25 بعد نمو الورم المغروس واصبح بعد المعاملة العلاجية 4.5±0.22 مع المستخلصB6, 2.0±0.005 مع المستخلصB11 بالمقارنة مع 1.8±0.009 في مجموعة السيطرة السالبة, وهذا يشير الى فروق معنوية عند مستوى p<0.05. كما تبين ان لطول فترة المعاملة بعد الغرس مع كلا الجرعتين العلاجيتين تاثيرا في نسبة خفض احداث الشذوذ الكروموسومي, حيث انخفضت متوسطاتها من 8.8±0.28 الى 4.0±0.02 بعد ثلاث اسابيع والى 5.0±0.02 بعد ستة اسابيع مع1\ 10 من قيمةLD50 و5.0±0.02بعد ثلاث اسابيع و4.0±0.01 مع1\2 قيمة LD50 وهذا يشير الى ان الجرعة الاولى تفقد تاثيرها مع ازدياد فترة المعاملة في حين ان الجرعة الثانية تكون اكثر تاثيرا مع ازدياد فترة المعاملة.تسببت المعاملة داخل الجسم لذكور الفئران مع الجرعتين العلاجية 1\ 10 و1\ 2 من قيمة LD50 في حث انواع الشذوذ الكروموسومي حيث كان متوسط مجموع انواع الشذوذ التركيبي 4.0±0.17, 4.1±0.13 مع1/10و 1/2قيمة LD50 على التوالي من B6 و5.1±0.31, 5.1±0.14 معB11 وهي فروق معنوية عند مستوى p<0.05 بالمقارنة مع قيم السيطرة السالبة 2.1±0.1. اما بالنسبة لانواع الشذوذ العددي فقد كانت متوسطات مجموعها 8.0±0,3, 8.o±0,2 مع 1\ 10 و1\ 2 قيمة LD50 على التوالي بالنسبة للبكتريوسينB6, 7.6±0.1 و8.1±0.17 وهي فروق معنوية عند مستوىp< 0.05 بالمقارنة مع قيم السيطرة السالبة التي بلغت 1.8±0.009. كما تسببت المعاملة في خفض الفعالية الميتوزية MI, فقد ظهرت فروق معنوية عند مستوىp<0.05 بالمقارنة مع السيطرة السالبة 75.6±0.9 حيث بلغت 46.6±1.5, 43.0±0.3 مع البكتريوسينB6 و38.9±0.2, 37.2±0.3 مع البكتريوسينB11. وقد تسببت المعاملة لذكور الفئران البيضاء في حث انواع الشذوذ الكروموسومي في الخلايا الابتدائية المولدة للنطف حيث ظهرت فروق معنوية عند مستوىp<0.05 في متوسط مجموع الشذوذ التركيبي بالمقارنة مع السيطرة السالبة 1.8±0.17 في حين بلغت 3.4±0.6 و4.1±0.6 بالنسبة لB6, 7.9±2.6 و8.2±2.5 بالنسبة لB11. اما انواع الشذوذ العددي فقد ظهرت فروق معنوية عند مستوىp<0.05 في متوسط المجموع الكلي حيث بلغ 6.6±1.01 في السيطرة السالبة, 11.0±2.01 بعد ستة اسابيع من المعاملة مع المستخلصB11. وقد حثت تشوهات في الشكل الظاهري للنطف الناضجة بالمعاملة مع البكتريوسين, فقد ظهرت فروق معنوية عند مستوىp<0.05 في متوسط مجموع التشوهات حيث بلغت 19.8±0.73 في السيطرة في حين وصلت 23.0±1.0 مع B6, 26.8±1.15 معB11. تسببت المعاملة العلاجية بالبكتريوسين في خفض مستوى التلف في دنا الخلايا الكبدية للفئران الحاملة للاورام المغروسة, حيث لحظت فروق معنوية عند مستوىp<0.05 في قيم OTM والتي بلغت 0.19±0.03 في السيطرة السالبة, 3.73±0.69 في الفئران المغروسة وانخفضت بعد المعاملة العلاجية الى2.16±0.59, 0.998±0.32 بعد ثلاثة وسته اسابيع على التوالي مع B6. وبلغت2.72±0.576, 1.216±0.387 بعد ثلاثة وسته اسابيع على التوالي مع B11. كما تسببت المعاملة العلاجية في خفض معنوي عند مستوىp<0.05 للنسبة المئوية للخلايا الحاوية على الدنا المتضرر, حيث كانت نسبتها في السيطرة السالبة 98.5±9.0 وانخفضت الى87±0.78, 58.7±5.88 بعد ثلاث وست اسابيع على التوالي مع B6, اما مع B11 فقد بلغت 92±8.25, 64.8±7.21 بعد ثلاثة اسابيع وست اسابيع على التوالي. اما عند معاملة الخلايا اللمفاوية لمزارع الدم الكامل للانسان بتراكيز مختلفة من البكتريوسين فقد تم حث تكوين النوى الصغرى باسلوب معتمد على الجرعة حيث بلغ عددها في السيطرة السالبة 17 مع الواهب الاول و13 مع الواهب الثاني في حين تسببت التراكيز العالية في فروق معنوية عند مستوى p<0.05 وp<0.01 حيث بلغت 33 و35 مع التركيزين 100, 500 µg/ml على التوالي بالنسبة للواهب الاول. كما نتجت زيادة معنوية في متوسط مجموعSCEs مع التركيز500µg/ml بلغت 8.10±0.41 بالنسبة للواهب الاول ولم تلحظ زيادة معنوية بالنسبة للواهب الثاني مع B6, في حين حدثت زيادة معنوية عند مستوىp<0.05 وp<0.01, حيث بلغت 9.54±0.35 و9.54±0.33 مع التركيزين100, 500 µg/ml على التوالي مقارنة مع 7.14±0.35 بالنسبة للسيطرة السالبة مع الواهب الاول, وبلغت 9.74±0.50, 10.68±0.45 مع التركيزين نفسهما بالنسبة للواهب الثاني. اما عند معاملة خطوط الخلايا السرطانية والطبيعية فقد وجد تباينا في تاثير المستخلصين B6 وB11 اعتمادا على نوع الخلايا ومدة المعاملة. كما وجد تماثلا في الفعل القاتل الذي يوجهه المستخلصين مع بعض الاختلافات. بالنسبة للخط الخلوي AMN - 3 وجدت فروق معنوية عند مستوى p<0.05 في متوسط اعداد الخلايا الحية بعد 24 و48 ساعة من المعاملة مع التراكيز الواطئة ومع التركيز الاعلى بعد72 ساعة من المعاملة مع المستخلصين B6 وB11, اي ان الخلايا تزداد مقاومة مع طول مدة المعاملة. واختلف نمط التاثير بالنسبة للخط الخلوي RD اذ وجدت فروق معنوية عند مستوى p<0.05 في متوسط اعداد الخلايا الحية بعد المعاملة مع التراكيز العالية لمدة 24 ساعة واختفى التاثير عند المعاملة مع المستخلصين لمدة 48 ساعة ليعود فيظهر مع التراكيز الواطئة مما يشير الى احتمالية احداث تغيرات في المادة الوراثية للخلايا. وتماثل تاثير كل من المستخلصين في خلايا الخط الخلوي السرطاني Hela اذ لم توجد فروق معنوية بين السيطرة والمعاملة بعد 24 و48 ساعة بينما وجدت فروق معنوية عند مستوى p<0.05 في متوسط اعداد الخلايا الحية بعد المعاملة لمدة 72 ساعة ويشير هذا الى ازدياد التاثير في الخلايا مع طول مدة المعاملة وبالنسبة للخط الخلوي AMG وجدت فروق معنوية عند مستوى p<0.05في متوسط اعداد الخلايا الحية بعد 24, 48 ساعة من المعاملة مع التراكيز الواطئة واقتصر التاثير على التركيز الاعلى من المستخلصB6 والمستخلص B11 بعد 72 ساعة من المعاملة واما بالنسبة للخط الخلوي الطبيعي المتحول L20B, فقد تباين تاثير كل من المستخلصين B6 وB11 اذ وجدت فروق معنوية في متوسط اعداد الخلايا الحية بعد 24 ساعة من المعاملة مع ادنى تركيز من المستخلص B6 والتركيزين الاعلى والاوسط من المستخلصB11 وتماثل سلوك خلايا هذا الخط مع خلايا الخط السرطاني RD اذ انعدمت الاستجابة بعد 48 ساعة من المعاملة مع كل من المستخلصين لكنها اختلفت بعد72 ساعة من المعاملة اذ ازدادت مقاومة الخلايا. | The study was designed to test effect of bacteriocin extracted from Staphylococcus aureus isolated in cancer and normal cells in vitro and in vivo. clinical The study includes : - Isolation and identification of Staphylococcus aureus from clinical samples of wounds(33)20% , burns(13)8% and fasterrs(33)20%,cases in Al - Salaam, Al - Khansah, Abn - Atheer, Ibn Sena, Al - gamhoory hosphtalofMosul city.The study started from Feb.(2007) to Oug(2007). Isolation and identification of bacteriocin producing strains, extraction of produced bacteriocin by competent strains, purification and charachterization of extracted bacteriocin, evaluation of therapeutic ability of extracted bacteriocin against transplanted mammary tumor in white mice females, determination of bacteriocin effect 0n human lymphocytes of whole blood culture and determination .of bacteriocin effect in five of cancer and normal cell lines. The evaluation conducted by : - Determination of chromosome aberration in bone marrow cells, Determination of chromosome aberration in primary spermatocytes, determination of morphological abnormalities in mature sperms, determination of genetic damage in hepatic cells by comet assay, determination of genetic damage in human lymphocytes by micronucleus test and SCEs test, determination of inhibition effect in cancer and normal cells growth result from treatment with different concentrations of bacteriocin for different times. 163 S aureus isolates from 250 samples of wounds , burns and fasterrs ,14/163 has been detected as competent producing isolates, 2/14 isolate showed DNase and plasma membrane damage effect. These two isolates used to produced bacteriocin which used for testing its effects in this study. Free extracted bacteriocin showed stability in storing at 4ºC. Ammonium sulfate used to precipitate the bacteriocin. Separation was conducted by 100G sephadex column. Lypholization and weighing of powder in order to using in LD50 determination and therapeutic treatment and genotoxicity study with 1/2, 1/10 LD50 and dose of 1/100 LD50 and its half dilutions in treatment of cancer and normal cell lines.Chromosome aberrations associate with growth of transplanted tumor in mice females which of two type, structural aberration as chromosome breakage, chain IV and numeric aberration as chromosome attenuation and endomitoses.In vivo treatment with bacteriocin showed chromosome aberration types in bone marrow cells and primary spermatocytes.Chain IV, X - Y univalents and autosomal univalents was observed, polyploidy was observed too.Sperm morphological abnormalities was observed as amorphous head, with out hook, small and big head and banana shape, coiled tail was noticed too.Therapeutic treatment with B6 and B11 bacteriocine caused enhancement of mitotic activity MI and reducing of structural and numerical aberrations. Its total average was 8.4±0.25 after growth of transplanted tumor, after therapeutic treatment was 4.5±0,22 with B6, 2.0±0.005 withB11 compared with 1.8 ±0.009 of negative control, this refer to significant differences at p<0.05. Treatment with the two used doses in decreasing percentage of chromosome aberration its averages decreased from 8.8±0.28 to4.0±0,02 after 3 weeks and to 5.0±0.02 after 6 weeks with 1/10 LD50 and to 5.0±0.02 after 3 weeks, 4.0 ±0.01 after 6 weeks with 1/2 LD50.In vivo treatment of male white mice with the two therapeutic doses 1/10, 1/2 LD50 cause induction of CAs types. Average of total structural aberrations 4.0±0.17, 4.1±0.13 with 1/10 and 1/2 of LD50 respectively with B6, 5.1±0.31 and 5.1±014 with B11 which is significant differences when compared with negative control 2.1±0.1. Average of total numerical aberrations was 8.0±0.3, 8.0±0.2 with 1/10 and 1/2 LD50 respectively of B6, 7.6±0.1 and 8.1±0.17 with 1/10 and 1/2 LD50 respectively of B11 which show significant differences when compared with negative control 1.8±0.009. Treatment caused decrease of mitotic activity (M!), there were significant differences at p<0.05 when compared with negative control 75.6±0.9. It reached 46.6±1.5, 43.0±0.3 with B6 and 38.9±0.2, 37.2±0.3 with B11. Treatment of male white mice induce chromosome aberration types in primary spermatocytes which showed significant differences at p<0.05 of total average of CAs when compared with negative control 1.8±0.17 while it reached 3.4±0.6 and 4.1±0.6 with B6 and 8.2±2.5 with B11.Sperm morphological abnormalities induced by treatment with bacteriocin, it showed significant differences at p<0.05 in total average abnormalities which reached 19.8±0.73 for control while reached 23.0±1.0, 26.8±1.19 for B6 and B11 respectively. Therapeutic treatment caused decrease in level of damage in hypatocytes DNA of tumor carrier mice. Significant differences was observed at p<0.05 in OTM which reached 0.19±0.03 in negative control, 3.73±0.69 in transplanted mice and decreased to 2.16±0.59, 0.998±0.32 after treatment for 3 and 6 weeks respectively with B6. It reached 2.72±0.576, 1.216±0.387 after 3 and 6 weeks respectively with B11. Therapeutic treatment cause significant decrease at p<0.05 in percentage of cells with damaged DNA. Percentage in negative control was 98.5±9.0 and decreased to 87.0±0.78, 58.7±5.88 after 3 and 6 weeks respectively with B6 and with B11 reached to 92.0±8.25 and 64.8±7.21 after 3 and 6 weeks respectively. Treatment of human lymphocytes in whole blood cultures with different concentrations of bacteriocin induce micronucleus formation in dose dependent manner. Its number reached 17 and 13 in 1st and 2nd donors respectively in negative control cultures. High concentrations of bacteriocin caused significant differences at p<0.05 and p<0.01, which reached 33and 35 with 100 and 500µg/ml respectively for 1st donor. Significant increase at p<0.05 resulted in total average of SCEs with 500µg/ml which reached 8.10±0.41 for 1st donor. No significant increase was observed for 2nd donor with B6, while significant increase at p<0.05 and p<0.01 resulted , which reached 9.94±0.35 and 9.54 ±0.33 with 100 and 500µg/ml respectively when compared with 7.14±0.35 for negative control cultures of 1st donor, and 10.68±4.5, 9.74±0.50 with the same concentrations for 2nd donor.When Cancer and normal cell lines treated, Different effect was existed by either of B6 and B11 extract and this depend ed on kind of cells and time of treatment. Similar killing effect of the two extracts was existed with some difference. For the cancer cell line AMN - 3 significant differences at the level P<0.05 in mean of viable cells numbers after 24 and 48 h of treatment with lower concentrations and with the highest concentration after 72 of treatment with the two extracts B6 and B11, that means increased cell resistance with the time of treatment. The mode of effect was different for cancer cell line RD, there were significant differences at P<0.05hn mean of viable cell number after treatment with the higher concentrations for 24 h , the effect disappeared with the treatment of 48 h which returned with the lowest concentrations with treatment of 72 h that refer to the possibility of occurred changes in cells genetic material. The effect of the two extracts in the cancer cell lines Hela which showed no significant differences Between the control and treatment after 24 and 48 h but significant differences at P<0.05 was excited in mean of cell numbers after treatment for 72 h which refer to increased effect in the cells with the durance of treatment, for the cancer cell line AMG - 5 significant differences was excited at P<0.05 in the mean of cell numbers after 24 and 48 the lowest concentrations and with the highest concentration of the extracts B6 and B11 after 72 h of treatment. While for the transformed normal cell line L20B the effect of either of the two extract B6 and B11 was variant which showed significant differences in mean of viable cell numbers after 24 h of treatment with the lowest concentration of the extract B6 and the highest and median concentrations of the extract B11, their the behaviour of this cells was similar with the cells of cancer cell line RD which showed no response after 48 h of treatment with the two extracts which disappeared but it different after 72 h of treat men which refer to increased cells resistance.
