انتاج وتنقية وتوصيف البلانتريسين من سلالات محلية لبكتريا Lactobacillus plantarum == Production, Purification and Characterization of Plantaricin from Local Strains of Lactobacillus plantarum
Author name:
ولاء شوكت علي
Supervisor name:
رشيد محجوب مصلح
General topic:
Biology
Specific topic:
Microbiology - Bacteria
Degree:
Doctorate
University:
University of Baghdad
Language:
Arabic
University location:
Baghdad
First pages:
24T3062 - p.pdf
Abstract:
تم الحصول على 118 عزلة تعود لجنس عصيات الحليب Lactobacillus من الخضر المتخمرة والعجائن الحامضية، واخضعت جميع هذه العزلات للفحوصات الزرعية والمجهرية فضلا عن الفحوصات الكيموحيوية بغية تشخيصها حتى النوع واظهرت النتائج ان 73 عزلة منها تعود للنوع Lactobacillus plantarum ، منها 48 عزلة من الخضر المتخمرة و25 عزلة من العجائن الحامضية، وكانت هذه البكتريا سائدة في الخضر المتخمرة اذ بلغت نسبة عزلها 73.85% بينما بلغت نسبتها في العجائن الحامضية 47.17% . تم التحري عن قابلية عزلات بكترياLb.plantarum على انتاج البلانتريسين باستخدام 3 طرائق هي : الاشرطة المتقاطعة(flip - streak method) والتنقيط (spot on the lawn method) والانتشار بالحفر(well diffusion method) ضد 12 نوعا من البكتريا الموجبة والسالبة لصبغة غرام والمتضمنة : Staphylococcus aureus وStaphylococcus epidermidis وListeria monocytogenes وEnterococcus feacalis وLactobacillus acidophilusو Bacillus spp. وPseudomonas aeruginosa وPseudomonas fluorescens وSerratia marcescens وSalmonella typhi و. Klebsiella sppو Escherichia coli. واظهرت النتائج ان 8 عزلات كانت منتجة للبلانتريسين بطريقة flip - streak و7 عزلات كانت منتجة له بطريقة spot on the lawn بينما استطاعت 12 عزلة من انتاجه بطريقة الانتشار بالحفر،مما يدل على ان انتاج البلانتريسين في الاوساط السائلة كان افضل من انتاجه في الاوساط الصلبة،وعدت طريقة الانتشار بالحفر هي الافضل في التحري عن انتاج البلانتريسين. اظهرت البلانتريسينات المنتجة من عزلات Lb.plantarum فعالية عالية ضد P. aeruginosa عندما ابدت 83.3% من هذه العزلات فعاليتها التثبيطية ضد هذه البكتريا بينما اظهرت 16.7% فقط من هذه العزلات تاثيرها التثبيطي ضد بكتريا Lb. acidophilus ولم تبد اية عزلة من عزلات Lb.plantarum اية فعالية تثبيطية ضد بكتريا Bacillus spp. ، هذا وكانت العزلة Lb.plantarumVGW8 هي الافضل في انتاج البلانتريسين اذ تمكنت من انتاجه في الاوساط الصلبة والسائلة بالطرائق الثلاثة اعلاه، فضلا عن فعاليتها التثبيطية العالية تجاه 10 انواع من البكتريا الموجبة والسالبة لصبغة غرام. هذا وقد حددت الظروف المثلى لانتاج البلانتريسين من العزلة VGW8 Lb.plantarum واظهرت النتائج ان الوسط الامثل للانتاج كان الوسط المحضر مختبريا في هذه الدراسة والذي اطلق عليه وسط الانتاج السائل ورمز له (PLM) المتكون من 2% كلوكوز و2% ببتون و1.5% مستخلص الخميرة و1.5% مستخلص اللحم و0.25% من ملح K2HPO4 و0.5% من مادة tween 80 ،برقم هيدروجيني(pH) 5 وبدرجة حرارة30 م وبحجم لقاح 2% من المزروع البكتيري الذي يحتوي على 1×109 خلية /مل ولمدة حضانة 12 ساعة في ظروف لاهوائية. تمت في هذه الدراسة ايضا تنقية البلانتريسين اذ سخن المستخلص الخام للبلانتريسين بدرجة 80 م لمدة 10 دقائق قبل البدء بالتنقية والتي تضمنت خطوتين الاولى هي الاستخلاص بالمذيب العضوي (البيوتانول) والثانية الفصل بطريقة كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي باستخدام عمود (Sepharose 6B). وقد اظهرت النتائج الحصول على البلانتريسين بفعالية نوعية 10666.67 وحدة/ملغم بروتين وبعدد مرات تنقية بلغ 13.067 وبحصيلة نهائية 12%.اطلق على البلانتريسين النقي اسم بلانتريسين VGW8 نسبة الى العزلة المنتجة Lb.plantarumVGW8 .كذلك فقد تم توصيف البلانتريسين المنقى VGW8 واظهرت النتائج ان وزنه الجزيئي كان 14400 دالتون بطريقة الترحيل الكهربائي بوجود المادة الماسخةsodium dodecyl sulfate(SDS) . واظهرت فعالية البلانتريسين النقي ثباتية عالية في قيم من الرقم الهيدروجيني(pH) تراوحت ما بين 3 الى 9 ،اذ احتفظ بكامل فعاليته عند تلك القيم لكنه فقد نصف فعاليته في pH( 2 و10) وكامل فعاليته في pH القاعدي (11 و12).كما اظهرالبلانتريسين ثباتية عالية تجاه المعاملات الحرارية المختلفة (20 - 100) م لمدد زمنية مختلفة شملت (10 و30 و60) دقيقة ويلاحظ من النتائج انه في الوقت الذي تمكن فيه البلانتريسين من الاحتفاظ بكامل فعاليته عند المعاملات الحرارية المختلفة (20 - 80 ) م للمدد الزمنية اعلاه، لم يتمكن من استرداد سوى نصف الفعالية عند تعرضه لدرجة حرارة 100 م لمدة 60 دقيقة او عند تعرضه لدرجة حرارة المؤصدة (121 م) لمدة 15 دقيقة. كما بينت النتائج طبيعة البلانتريسين البروتينية عندما فقد كامل فعاليته بعد معاملته بالانزيمات الحالة للبروتين ( ببسين وتربسين وبابين) في حين لم تتاثر فعاليته عند معاملته بالانزيمات (لايبيز والفا - اميليز ولايسوزايم).كذلك فقد اظهر البلانتريسين ثباتية عالية بعد معاملته بالمذيبات العضوية(كلوروفورم واسيتونايترل وداياثيل ايثر وايثانول وميثانول وايزوبروبانول وتولوين واثيل اسيتيت)، والمنظفات (توين80 وتوين20 وترايتون اكس100و EDTA ويورياو SDS) ، وبعض الايونات الفلزية (الصوديوم والبوتاسيوم والكاليسيوم والباريوم والزنك والحديد) حيث استعاد كامل فعاليته بعد معاملته بها لكن فعاليته انخفضت الى النصف بوجود ايوني المغنيسيوم والمنغنيز.تمت ايضا دراسة فعالية البلانتريسين VGW8 ضد P.aeruginosa وS.aureus واظهرت النتائج ان البلانتريسين يمتلك الفعالية القاتلة للبكتريا عندما انخفضت اعداد البكتريا مع زيادة تركيز البلانتريسين الى 320 وحدة /مل، فقد اظهرت النتائج ان هذا التركيز كان كافيا لقتل بكتريا P.aeruginosa بعد ساعتين من التعرض للبلانتريسين ولقتل بكتريا S.aureus بعد اربع ساعات من التعرض له. ايضا فقد تمت دراسة الفعالية التحللية للبلانتريسين VGW8 واوضحت النتائج انه يمتلك الفعالية الحالة للغشاء الخلوي عندما انخفضت الامتصاصية الضوئية عند الطول الموجي 600 نانوميترمن 0.59 الى 0.17 لبكتريا P.aeruginosa بعد ساعتين فقط من التعرض للبلانتريسين وبتركيز 320 وحدة/مل ، ومن 0.51 الى 0.20 لبكتريا S.aureus بعد 4 ساعات من التعرض للبلانتريسين وبالتركيز نفسه(320 وحدة/مل).وتمت ايضا دراسة تاثير البلانتريسين VGW8 على نفاذية الخلية وبينت النتائج ان الامتصاصية الضوئية عند الطول الموجي 260 نانوميتر قد سجلت زيادة من 0.5213 الى 2.9112 لبكتريا P.aeruginosa ومن0.4614 الى 2.6405 لبكتريا S.aureusدليلا على خروج الحامض النووي (DNA) من الخلايا نتيجة لتحللها.يتضح من هذه النتائج ان هدف البلانتريسين VGW8 هو الغشاء الخلوي. | A total of 118 isolates of Lactobacillus were obtained from fermented vegetables and sourdoughs. All the isolates were subjected to the cultural, microscopical and biochemical examinations for the identification of species. The results showed that 73 isolates belongs to Lactobacillus plantarum, 48 isolates from fermented vegetables and 25 isolates from sourdoughs. Lb. plantarum was dominate in fermented vegetables with 73.85% percentage of isolation while in sourdoughs the percentage of isolation was 47.17%.Three methods (flip - streak, spot on the lawn and agar well diffusion methods) were used to detect of plantaricin production by Lb. plantarum isolates against 12 species of Gram positive and Gram negative bacteria which included, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes, Enterococcus feacalis, Lactobacillus acidophilus, Bacillus spp., Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens and Klebsiella spp. The results showed that 8 isolates produced plantaricin by flip - streak method, 7 isolates produced it by spot on the lawn method, while by the agar well diffusion method ,12 isolates were able to produce plantaricin, suggesting that the production of plantaricin was best in the broth medium than in the solid medium. The agar well diffusion method was considered the best one for detection of plantaricin production. Plantaricins of Lb. plantarum isolates exhibited high activity against P. aeruginosa when 83.3% of Lb. plantarum isolates showed antibacterial activity against this bacterium, whereas the lowest activity was against Lb. acidophilus when 16.7% of Lb. plantarum isolates showed antibacterial activity against it. No activity against Bacillus spp. was observed.Lb. plantarum VGW8, was the best isolate for plantaricin production. It produced it in both broth and solid media by all detection methods used in this study, this plantaricin exhibited a broad spectrum of activity against 10 species of both Gram positive and Gram negative bacteria. The optimum conditions for plantaricin production by Lb. plantarum VGW8 were determined and the results showed that the best production medium was production liquid medium (PLM) that prepared in this study, it composed of 2% glucose, 2% peptone, 1.5% yeast extract, 1.5% beef extract, 0.25% K2HPO4 and 0.5% tween 80,with pH 5, temperature 30°C for 12 hours under anaerobic conditions and inoculum size of 2% of cells number 1×109cell/ml.Purification of plantaricinVGW8 was made by heating crude plantaricin at 80ºC/10min and then purified by two steps method including extraction with n - butanol followed by gel filtration chromatography on Sepharose 6B column, the results showed that the specific activity was 10666.67AU/mg protein with 13.067purification folds and 12% recovery yield. The purified plantaricin was called plantaricin VGW8 according to the producer isolate Lb. plantarum VGW8.Physical characteristics were also studied and the results showed that the molecular weight of plantaricin VGW8 was 14400 Dalton by sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis (SDS - PAGE). Plantaricin VGW8 activity was stable at pH values (3 - 9) but 50% of its activity was lost at (2 and 10) pH values, and whole activity was lost at extreme alkali pH values(11 and 12).Also, plantaricin VGW8 showed high thermostability at different temperatures (20 - 100)°C for (10,30 and 60)min, it remained active after being treated with (20 - 80)°C for the periods above, but it retained only 50% of its activity after treatment at 100°C for one hour and autoclaving treatment (121°C/ 15 min).The results showed that the activity of plantaricin VGW8 disappeared when it treated with proteolytic enzymes (pepsin, trypsin and papain), whereas it retained whole activity when treated with lipase, lysozyme and α - amylase, indicating pure proteinaceous nature of purified plantaricin.As well as, treatment of plantaricin VGW8 with organic solvents (chloroform, acetonitrile, diethyl ether, ethanol, methanol, isopropanol, toluene and ethyl acetate), surfactants (tween 80, tween 20, triton X - 100, SDS, EDTA and urea) and the metal ions : Na, K, Ca, Ba, Zn and Fe, showed no effect of these treatments on the activity of plantaricin VGW8.While treatment with Mn and Mg reduced its activity to the half.The antibacterial activity of plantaricin VGW8 was studied against P. aeruginosa and S.aureus. It was observed that plantaricin VGW8 has bactericidal effect when the numbers of cells were decreased with increasing of plantaricin VGW8 concentration to 320 AU/ml. The results showed that the complete killing of P. aeruginosa was observed after 2 hours of incubation with 320 AU/ml of plantaricin VGW8, while the same effect was observed after 4 hours on S.aureus. Also, the lytic activity of plantaricin VGW8 was studied, and the results showed that exposure P. aeruginosa and S.aureus to 320 AU/ml of plantaricin VGW8 led to decrease absorbance at 600nm from 0.59 to 0.17 for P. aeruginosa within 2 hours and from 0.51 to 0.20 for S.aureus within 4 hours. Moreover, the effect of plantaricin VGW8 on the cell permeability was studied and the results showed that absorbance at 260nm increased from 0.5213 to 2.9112 for P. aeruginosa and from 0.4614 to 2.6405 for S.aureus, indicating that DNA leaked from cells due to the cell lysis. This means that the cell membrane is the target of plantaricin VGW8.
